Numero 29/2021

22 Luglio 2021

Rilevamento spoiler di birra in PCR: come funziona la tecnologia?

Rilevamento spoiler di birra in PCR: come funziona la tecnologia?

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Tutti i microrganismi “spoiler” della birra possiedono il DNA (acido desossiribonucleico) che contiene le istruzioni genetiche per lo sviluppo e la funzione degli esseri viventi. Mentre negli animali, nelle piante e nei lieviti il DNA è contenuto nel nucleo cellulare, nei batteri il DNA è presente nel loro citoplasma (il materiale presente all’interno di una cellula, racchiuso dalla membrana cellulare).

La reazione a catena della polimerasi (PCR) è un test semplice ed elegante inventato nel 1983 dal biochimico americano Kary Mullis, il quale ottenne, per questo, il premio Nobel per la Chimica (1993). Come ha sottolineato nella sua pubblicazione più importante (1990), “La PCR ti permette di scegliere un qualsiasi tratto di DNA che ti interessa e di moltiplicarlo quante volte vuoi”. Sono necessarie solo tracce di DNA affinché la PCR generi copie sufficienti ad essere analizzate utilizzando i metodi di laboratorio convenzionali. Per questo motivo la PCR è considerato un test così sensibile.

Oggi è un metodo ampiamente utilizzato in biologia molecolare e, mentre 5 anni fa era ancora considerata una tecnologia applicabile solo nei grandi laboratori centrali e istituti di ricerca per via degli investimenti necessari sia nelle apparecchiature che nelle condizioni specifiche di sterilità, in tempi più recenti si è assistito ad una semplificazione dei protocolli e delle apparecchiature (Termociclatore) consentendo così una “democratizzazione” della tecnologia PCR utilizzata adesso come un vero e proprio strumento di produzione in loco – presso il birrificio – e durante tutti i controlli di processo alimentare.

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DA COSA È FATTO IL DNA?

Le informazioni nel DNA sono memorizzate come un codice composto da quattro basi chimiche: adenina (A), guanina (G), citosina (C) e timina (T). Le basi del DNA si accoppiano tra loro, A con T e C con G, per formare unità chiamate coppie di basi. Ogni base è anche attaccata a una molecola di zucchero e ad una molecola di fosfato. Insieme, una base, uno zucchero e un fosfato vengono chiamati nucleotidi. I nucleotidi sono disposti in due lunghi filamenti che formano una spirale chiamata doppia elica.

Una proprietà importante del DNA è che può replicarsi o fare copie di se stesso. Ogni filamento di DNA nella doppia elica può servire da modello per duplicare la sequenza di basi.

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UNO SGUARDO PASSO-PASSO SU COME FUNZIONA LA PCR nel RILEVAMENTO DEI MICROrganismi SPOILER DELLA BIRRA

1. Estrazione del DNA da batteri o lieviti:

Il campione viene centrifugato per concentrare le cellule dei microrganismi “spoiler” prima di aggiungere un buffer specifico necessario alla rottura delle pareti cellulari.

 

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Estrazione del DNA dalle cellule dei microrganismi target

2.Il DNA del microrganismo “spoiler” viene quindi aggiunto alla “soluzione master mix” PCR che contiene tutti gli elementi necessari per la reazione (replicazione del DNA) e viene posto in un Termociclatore.

 

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3. L’alta temperatura applicata permetterà di separare i due filamenti di DNA (Denaturazione), mentre la successiva riduzione della temperatura consentirà ai “primer specifici del microrganismo spoiler” di cercare il loro codice DNA corrispondente e allinearsi di fronte a loro (Annealing).

4. Con i primer in posizione, l’enzima (DNA Polimerasi) sa dove iniziare e terminare la sua sintesi di un nuovo filamento per creare un nuovo doppio filamento (Estensione).

E così da 1 filamento se ne formano 2 dopo un ciclo completo. I cicli vengono poi ripetuti per un numero definito di volte all’interno del “Termociclatore”.

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Alla fine di ogni ciclo, il prodotto della PCR (Amplicone) aumenterà in modo esponenziale poiché le sequenze di DNA appena sintetizzate possono essere utilizzate come stampi (oltre allo stampo di DNA originale). Di solito sono sufficienti da 20 a 30 cicli di PCR standard per ottenere 2^30, ovvero oltre un miliardo di molecole di DNA identiche.

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  1. La lettura degli ampliconi sintetizzati dalla PCR può avvenire in due modi:
  2. a) Real Time PCR (qRT-PCR)si basa sul principio per cui quantità iniziali maggiori o minori di una specifica sequenza di DNA (presenza di spoiler di birra) porteranno rispettivamente a concentrazioni maggiori o minori di ampliconi. Quando gli ampliconi vengono sintetizzati, si contrassegnano con un marker di fluorescenza che potrà quindi essere “letto” da un lettore laser (o ottico) e interpretato secondo il software del Termociclatore per dedurre la concentrazione dell’amplicone.

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Il risultato è spesso espresso come valore Ct che rappresenta il numero del ciclo PCR in corrispondenza del quale la curva di reazione del campione interseca una linea di soglia prestabilita. Questo valore indica quanti cicli sono stati necessari per rilevare un segnale reale nel campione iniziale. L’interpretazione dei risultati può essere difficile e richiedere spesso una certa esperienza per poter affermare in modo affidabile se esiste un rischio di contaminazione nella birra dovuta dalla presenza o meno di microrganismi “spoiler”.

  1. b)End-Point PCRcon la lettura del test rapido è anch’esso basato, come per la qRT-PCR, sul principio che quantità iniziali più alte o più basse di una specifica sequenza di DNA (presenza di spoiler di birra) porteranno rispettivamente a concentrazioni più alte o più basse di ampliconi. La differenza è che viene eseguito un numero fisso di cicli di temperatura e, man mano che ogni amplicone viene sintetizzato, invece del marcatore di fluorescenza viene attaccato un biomarcatore che verrà poi rilevato da uno specifico “anticorpo” presente sulla finestra di un test rapido. Come per un “test di gravidanza” il risultato è visivo e facilmente interpretabile da tutti. Non solo la presenza/assenza ma anche, quando presente, il grado di intensità della linea che può essere misurato grazie all’utilizzo di una scorecard “standard” per fornire un livello semi-quantitativo di cellule “spoiler” di birra originariamente presenti nel campione.

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QUALI SONO I REALI VANTAGGI DELLA PCR?

– Risultati rapidi in giornata per assicurare la massima reattività e analizzare subito i propri campioni

– Un test sensibile e specifico che genera risultati utilizzabili ben prima che la qualità della birra venga influenzata (la tecnologia PCR si sta dimostrando la soluzione microbiologica rapida di maggior rilevanza nel 21° secolo nel settore clinico e industriale)

– Facilità di implementazione in birrificio in cui non è sempre possibile l’accesso ad un microbiologo completamente formato

– Possibilità di rilevare sia le cellule vitali che le cellule VBNC (vitali ma non coltivabili)

– Infine, un test affidabile che consente di analizzare tutte le matrici del birrificio, comprese le materie prime, la birra nelle diverse fasi della produzione e l’ambiente del birrificio (ad esempio per le analisi post CIP)

PUNTI CHIAVE

  • La tecnologia della reazione a catena della polimerasi (PCR), in virtù della sua capacità di rilevare sequenze di codici DNA specifiche per gli spoiler di birra d’interesse, è sia molto specifica che sensibile
  • Negli ultimi 5 anni, la PCR ha subito una “democratizzazione” come risultato della semplificazione dei protocolli e della riduzione dei capitali necessari alle apparecchiature
  • Oggi, la PCR è considerata uno strumento veramente “orientato alla linea di produzione” a causa della sua capacità di ottenere risultati nello stesso giorno
  • Esistono due approcci alla tecnologia PCR: (1) End-Point PCR – amplificazione del segmento di DNA selezionato per un numero definito di cicli e quindi analisi del risultato; (2) RT-PCR – durante il processo di amplificazione, analisi in tempo reale dopo ogni ciclo del DNA presente
  • La PCR consente risultati sia qualitativi che quantitativi in base alla piattaforma
  • Il controllo qualità delle birre pastorizzate mediante PCR richiede un passaggio aggiuntivo per evitare la possibilità di “falsi positivi” per le cellule vitali

 

 

Per saperne di più sulle soluzioni rapide di bioMérieux dedicate ai birrifici compila il form oppure contatta direttamente: david.pierattoni@biomerieux.com

 

LEGGI L’ARTICOLO ORIGINALE: https://www.biomerieux-industry.com/food-safety-quality/resources/scientific-library/2020-11-25-part-6-pcr-detection-beer-spoilage

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Info autore

David Pierattoni

Responsabile dello sviluppo della diagnostica microbiologica per la sezione Birra & Vino di bioMérieux Italia. Dopo la laurea in Viticoltura ed Enologia conseguita presso l’Università degli Studi di Firenze nel 2012, ha acquisito importanti esperienze pratiche nel settore enologico, degli estratti vegetali e delle bevande alcoliche, in Italia e all’estero. Attualmente in bioMérieux, per quanto riguarda il settore brassicolo, gestisce lo sviluppo di soluzioni microbiologiche rapide per i birrifici artigianali, industriali e per i laboratori di analisi, progettate per valutare e garantire la qualità del prodotto finale.

La sua consolidata esperienza nel settore abbinata alla sua passione per la birra artigianale e per i distillati, contribuirà a stimolare la curiosità dei nostri lettori verso le analisi microbiologiche applicate all’industria birraria e a trasmetterne l’importanza.